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最近研究，癌变过程中发生的最典型的表观遗传修饰是抑癌基因启动子区域CpG岛的甲基化，调控该基因的表达量，若高度甲基化，基因甚至会沉默不表达，等效于基因发生突变或缺失而失活，这也有专家提出抑癌基因甲基化参与肿瘤发生的二次打击。近年来，CFDA也批准了若干个癌症的基因甲基化产品，包括肠癌、肺癌等，直至2022年8月，国家药监局才发出宫颈癌甲基化相关的第一张注册证。接下来我们讨论DNA甲基化作为女性肿瘤早期检测标记物的前景，及存在哪些方面的挑战。
一、讨论女性肿瘤筛查与诊断的现状
女性主要的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌。宫颈癌由于病因明确，癌症发生发展机制清楚，是WHO唯一推荐筛查的恶性肿瘤，有着规范的三阶梯诊疗模式，并且湘雅医学检验所推出的PAX1基因甲基化检测已广泛应用于临床。所以这里主要讨论乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌，虽然这些癌症都存在现有的筛查、诊断和治疗模式，但发病率和死亡率都很高，防治仍具挑战。
乳腺癌（BC）是女性最常见的癌症，每8名女性中就有1人患此病。钼靶X线或超声成像进行筛查，过度诊断是一个日益严重的问题，另外通过钼靶X光检查发现BC的妇女中，只有3% -13%的治疗效果得到改善[1]。
卵巢癌（OC）发病率低，但在早期，妇女大多无症状或有些非特异性的症状，使诊断就非常困难，目前尚无有效的筛检方法。阴道超声检查TVS是一种高灵敏度诊断方法。然而，它高度依赖于个人的专业知识[2]。
子宫内膜癌（EC）是最常见的妇科恶性肿瘤，EC若能早期诊断，是可以治愈的，目前没有建议常规筛查[3]。
结合来看，临床亟需新的标记物帮助解决女性肿瘤良恶性难区分、早期难发现、预后评估等问题。
二、了解DNA甲基化的癌症标记物
许多研究显示，甲基化特征几乎可以在任何体液（血清/血浆、涂片、乳头分泌物和阴道分泌物等）中检测到。血样可通过微创方式获得，并为DNA甲基化分析提供理想的样本。循环游离DNA在健康人血液中的平均浓度为30ng/ml。如果我们假设一个正常细胞的DNA含量为6.6 pg，这意味着平均每毫升血液中有5000个基因组的量。在癌症患者中，肿瘤DNA被死亡的癌细胞释放到血液中，血清中cfDNA的平均浓度较高，约为180 ng/ml[4]。
血清中肿瘤特异性DNA甲基化分析具有许多优势[5]：
1.灵敏度高
cfDNA容易PCR扩增，提高敏感度具有潜在可能性；
2.假阳性低
在一个特定基因上获得甲基化后，甲基化模式通常在疾病进展过程中相对保守；
3.阳性信号
DNA甲基化是可检测的阳性信号，而不是信号丢失，如染色体缺失；
4.稳定性高
异常DNA甲基化具有化学和生物学稳定性，相对不受生理状态和样品采集条件的影响；
5.操作性强
实时定量PCR的基因特异性分析很容易适应诊断实验平台，并且该方法的分析灵敏度和特异度非常高。
6.设计简单
基因启动子CpG岛高甲基化的选择比可能分散于基因的遗传改变（基因突变）具有优势。
由于DNA甲基化分析技术上的困难，目前只有少量DNA甲基化标记，比如HOXA9基因甲基化标记的问题出现在信噪比低，也就是正常细胞游离DNA非常多而癌症特异性信号非常少。现在由于技术的突破这已经不是问题，可以用dmPCR和NGS等手段来检测。
三、甲基化检测技术实现临床转化的桥梁（B2B：Bench to Bedside）
甲基化特异性PCR (methyl- specific PCR, MSP)是一种相对简单的方法，定性多于定量的。设计了两套靶区引物，一套扩增甲基化模板，另一套扩增亚硫酸氢盐转化后的未甲基化模板。与实时PCR相比，一种更为灵敏的方法是将数字PCR与MSP结合使用，这种方法被称为digital MethyLight（dmPCR）。由于数字PCR通常不受PCR效率差异的影响，并且能对DNA模板进行绝对定量，因此与实时PCR相比，数字PCR具有更好的敏感性和特异性。
临床检验的特异性需要充分考虑癌症类型和临床分期。在BC病例中，乳房钼靶X线筛查的过度诊断是一个令人担忧的问题，那么生物标志物确定预后不良的癌症，并将其与预后良好的癌症以及良性肿瘤进行区分。相比之下，OC的临床检验则需检出所有的病理类型。在标记物开发阶段，组织学分类对于解释甲基化模式的可变性是重要的，从而可以统计分层提高性能指标。寻找共同的甲基化模式而不是对比的模式可能是一个更有效的策略。
即使在最佳条件下，也不太可能有单一的标记能够满足人群早期检测OC的高特异性要求。可能的解决方法是建立一个多因素分析方法，多个甲基化位点或甲基化与基因组标记的结合。但这样的组合，灵敏度和特异性就需根据临床有所取舍，同时在开发、测试阶段都应仔细测试，开发难度增加。
四、总结
生物标志物开发进展缓慢一直是一个主要问题，其两大挑战是缺乏适当的技术和对疾病过程的深入了解。甲基化基因芯片和亚硫酸氢盐测序的帮助，我们可以找到合适的分子标记物，关键生物标记物将能够发现早期癌症或癌化病变，并且能够加深对肿瘤/癌症发生的认识。另一方面，也要有适应临床的技术能够将生物标志物的发现转化为临床可行的癌症血液基因甲基化早筛和辅助诊断。基因甲基化这个领域正在进行的研究有可能改进对所有主要女性癌症的诊断和治疗监测。
1. Welch, H.G. and B.A. Frankel, Likelihood that a woman with screen-detected breast cancer has had her "life saved" by that screening. Arch Intern Med, 2011. 171(22): p. 2043-6.
2. Yazbek, J., et al., Effect of quality of gynaecological ultrasonography on management of patients with suspected ovarian cancer: a randomised controlled trial. Lancet Oncol, 2008. 9(2): p. 124-31.
3. Siegel, R., D. Naishadham, and A. Jemal, Cancer statistics, 2013. CA Cancer J Clin, 2013. 63(1): p. 11-30.
4. Gormally, E., et al., Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance. Mutat Res, 2007. 635(2-3): p. 105-17.
5. Wittenberger, T., et al., DNA methylation markers for early detection of women's cancer: promise and challenges. Epigenomics, 2014. 6(3): p. 311-27.